特務機関NERV（ネルフ）本部のオペレーターで、階級は二尉。技術開発局一課に所属する24歳。赤木リツコのもとで指導を受けていた経歴があり、両者の信頼は厚く、また彼女自身のオペレーター技術は高い。

伊吹マヤは、人類補管計画の際、大好きなリツコ先生に抱き寄せられ、「先輩、先輩」と連呼しながらLCLの液状と化します。

生年月日：1955年4月9日

特務機関ネルフの副司令を務める初老の男性。総司令碇ゲンドウとはセカンドインパクト以前からの因縁の関係であり真の目的を共有する同志でもあります。

「冬月先生、あとは頼みます」といい残し後にするゲンドウの代わりに、最後の戦いの指揮を取る冬月。アダムとリリスが融合し、人類が全てLCLという液体に溶けていく中で、冬月の想いもユイの幻影ではあるものの再会するといった形で補完されます。その際の最期の言葉が「碇、お前もユイ君に会えたのか？」というゲンドウへの呼びかけでした。

生年月日：1977年

ショートカットと白衣が特徴的な清楚系の女性で、碇ゲンドウの妻で碇シンジの母。そして秘密結社ゼーレと関わりを持つ最重要人物であり、物語の鍵を握ります。

碇ユイは正しくは死亡しておらず、体が消滅し魂が初号機に宿っている状態です。そのため息子のシンジが危険な状態に陥ると、ユイの魂が宿っている初号機は自動的に再起動したり暴走を始めます。碇ユイが体を失う原因となったのはエヴァ初号機とのシンクロ実験。人の意思でエヴァを操縦することができるのかという実験の一環でエントリープラグに搭乗したユイでしたが、実験は上手くいかずユイの魂は初号機のコアに吸収されてしまいました。

三人目の綾波レイは、二人目が零号機自爆と共に死亡した後に誕生しました。最後の綾波レイは2人目までに見られなかった感情を持つようになっており、碇シンジに対して明確な恋心を抱くようになっています。それに伴い、自分の中に抱いていた碇ユイの感情を遠ざけ、ゲンドウと距離を置くようになりました。

ミステリアスな綾波レイの正体、そこには綾波レイのクローン（コピー）が大量に用意されていました。「もう一度皆に会いたい」と神であるシンジが他者のいる世界を望んだことで、人類補完計画は破綻。巨大な綾波レイの眼球から初号機が飛び出し、残された綾波レイの肉体はバラバラに崩壊していきました。

綾波レイの1人目が死亡し、零号機の正規パイロットになるまでに担当したのが2人目の綾波レイです。この2人目の綾波レイが彼女の特徴とも言える無感情といった状態で、常に無表情であり人付き合いも非常に悪い少女となっていました。ベット以外何もない状態の部屋も彼女の状態がよく表れています。ただ、1つだけ興味を持っていた存在がゲンドウでした。碇ユイの記憶が彼女に残っていたため、ゲンドウにだけ特別な感情を抱いていたようです。

第16使生徒アルミサエルに侵食され、シンジを守るために零号機とともに自らも巻き込み自爆します。使徒は壊滅するも、レイは死亡してしまいます。黒焦げとなったレイの手（綾波レイの黒焦げ死体）がうっすらと見えるシーンは視聴者に衝撃を与えました。

生年月日： 1986年12月8日

特務機関NERV（ネルフ）本部に所属する女性。役職は戦術作戦部作戦局第一課課長で階級は一尉。後に三佐に昇進します。碇シンジ・綾波レイ・惣流・アスカ・ラングレーらEVAのパイロット達の直属の上司に当たる人物で、EVAによる使徒殲滅作戦の作戦指揮を担当しています。

エヴァとは何か？使徒とは何か？NERFは何を行っている組織なのか？NERFに属しながらも、内部機密情報まで探っていくようになり、ミサトなりの真実を求めていきます。その全貌を知る前に、戦略自衛隊がネルフ本部に突入。シンジ達チルドレンを守るため拳銃で応戦するがシンジを連れ出そうとした時に被弾してしまう。深い傷を負いながらも何とかエレベーター前まで逃げ込み、渚カヲルに裏切られた事で塞ぎこんでいたシンジを奮い立たせるため今まで秘めていた自らの弱さを彼に明かす。そして父の形見であるペンダントを彼に渡し、「大人のキスよ。帰ってきたら続きをしましょう」と最期にシンジにキスをし、ミサトは爆発に巻き込まれてこの世を去ります。